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基因测序技术
         对于每个生物体来说,基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息,进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性。1954年Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列,这是出现的最早的基因测序技术的报道,在其后的50多年里,基因测序技术取得了突飞猛进的发展。
        1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法,标志着第一代测序技术的诞生。该方法的原理是:ddNTP的2´和3´都不含羟基,在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,因此中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的ddNTP,通过凝胶电泳和放射自显影后,可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。Gilbert法是先用特定的化学试标记碱基再用化学方法切断此序列,再通过电泳方法读出排序。20世纪90年代,通过第一代测序技术,我们完成了人类基因组计划,但由于耗时长,花费高等诸多原因限制了它的常规使用,但是通过不断的改进和发展,出现了第二代测序技术。
         第二代测序技术主要以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志。与第一代测序技术相比,第二代测序技术最显著的成果在于大大降低了测序成本并极大的提高了测序速度。这三种技术的原理类似,核心思想都是边合成边测序,即生成新DNA互补链时, 要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光,要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物,在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号,通过捕获光信号并转化为一个测序峰值,获得互补链序列信息。该测序技术单次反应可以对数以百万计的样品进行分析,这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。
        Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford  Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术被认为是第三代测序技术。与第一代和第二代技术相比,第三代最大的特点是单分子测序,该技术摒弃了之前测序平台所基于的PCR扩增信号放大过程,完全达到了检测单分子荧光的能力。基本原理:首先,将待测 DNA样品随机打断成小片段,在每个小片段的末端加上 poly-dA;然后, 将小片段DNA模板与固定在检测芯片上的 poly-dT引物进行杂交并精确定位,并逐一加入荧光标记的末端终止子。在掺入了单个荧光标记的核苷酸后,洗涤、成像,之后切开荧光染料和抑制基团,洗涤、加帽,允许下一个核苷酸的掺入。这样通过掺入、检测和切除的反复循环,即可实时读取大量序列。
        在临床诊疗方面,基因测序技术拥有传统 PCR方法所不具备的灵敏、精确、价廉、信息量大等优势,因而更适用于基因水平的检测。目前基因测序技术已经在临床相关诊断和治疗中得到了广泛应用,除了用于单基因遗传病检测外,感染性疾病、肿瘤、基因多态性和多基因遗传病等都可以运用测序仪进行分析,这表明以测序为基础的分子诊断技术应用到临床常规检验具有巨大的潜力。
        基因的点突变及缺失是分子病理检测的重要内容,个体化医疗和基因靶向治疗技术与基因点突变及启动子区多态性关系密切,常见的如乳腺癌患者BRCA12基因突变、结直肠癌K-RAS基因突变及非小细胞肺癌EGFR基因突变等在临床的应用逐渐增加,为序列分析金标准的基因测序技术的推广打下坚实基础。相信随着测序成本的进一步降低以及测序技术稳定性的持续提高,测序在临床分子病理的大规模应用将指日可待。



  

                                                                   基因测序检测点突变示意图


参考文献:
1.Saunier JL, Irwin JA, Strouss KM, et al. Mitochondrial control region se-quences from an Egyptian population sample. Forensic Sci Int Genet, 2009, 3(3): e97-103.
2.Hoberman R, Dias J, Ge B, et al. A probabilistic approach for SNP discovery in high-throughput human resequencing data. Genome Res, 2009, 19(9):1542-1552.
3.Morrissy AS, Morin RD, Delaney A, et al. Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profling. Genome Res, 2009, 19(10): 1825-35.

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