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怎样评价用于免疫组织化学检测的抗体
        临床试验室常面对抗体的供应商变了,抗体的克隆变了,当然随时也有可能引进新的抗体。这些改变都需要严格的质控体系去保证所引进的抗体符合质量要求。检测新抗体对每一个实验室来说是一个具有挑战性的工作,抗体可能是浓缩液也可能是“工作液”。国内多数医院和实验室喜欢选择即用型的“工作液”,认为方便,不需要考虑稀释比。但是除了即用型的成本比较高以外,严格来说制造商提供的即用型是根据制造商的实验条件所取得的,当实验室或医院的实验条件改变,其实验结果不可能完全复制,所以即用型抗体采取“拿来”即用,有可能难获得满意的结果。选择浓缩型的一抗,由于要对稀释比进行判断,实验工作要多一些,但实验室可用现有的配套试剂,实验室自己的标准化程序对抗体进行检查,有较大自主性,亦会降低抗体成本。在对抗体进行系列检测时,设立标准的检测程序、严格的质控,才能确保引进的抗体符合质量要求。
 
确定用于检测抗体的阳性和阴性质控组织

        在进行临床免疫组织化学的检测时,两类质控组织是必不可少的,阳性质控组织和阴性质控组织。阳性质控组织是已知有明确目标细胞蛋白的组织,反之阴性组织是已知没有目标细胞表达的组织。通常情况下,良性和正常组织其抗原表达较强,习惯上被选用做质控片,但应考虑到肿瘤由于分化程度不同,其抗原表达有差异,单纯用强抗原表达的组织做质控,有可能导致假阴性。所以,越来越多的病理学家建议用多组织质控,在质控片里包括了不同程度抗原表达的组织,特别是低抗原表达的组织,这对于提高抗体检测的敏感性,减低假阴性的发生极为重要。

判断抗体是否需要抗原修复以及最佳抗原修复液

        一般情况下,制造商会提供抗原修复的方法,但不排除其提供的信息不准确,不全面。抗原修复的方法,修复液众多。一般的实验室都有自己认为比较适合并经验证的抗原修复方法,比如微波炉,高压锅,蒸汽锅等,只要实验室确定好其规范的操作程序,不管那一种方式都可能取得其优化的效果。抗原修复液也有很多,每一种新抗体,要去验证所有的方法,几乎是不可行性。根据现在临床所用的抗体分析:EDTA、Citric acid、蛋白酶抗原修复液,98%的抗体对其中之一适用,再加上抗体研发生产商本着产品能最大限度地符合市场需求的目的,在研发新产品时尽可能地使用常规抗原修复液。所以,我们一般根据制造商提供的最佳稀释比,检测时一张不用抗原修复,一张蛋白酶修复, 一张citric acid, 一张EDTA进行抗原修复液的检测。一般来说,病理医生对比这些片子会得出抗体是否需要抗原修复,以及最佳的抗原修复液。

检测抗体稀释比
 
        用前面筛选出来的抗原修复法,对抗体进行系列稀释,供应商提供的稀释比可以作为稀释比开始点的参照。如供应商提供的稀释比是1:100.稀释比检测可以从1:50;1:100,1:200,1:400,1:800.等进行免疫组织化学染色。仔细研究染色的片子,确定抗体的特异性,敏感性,定位,选择出最佳的稀释比。
抗体的稀释比是根据阳性质控片来判断,如果是多组织质控片,其最佳稀释比的可靠性较高。反之,需要对最佳稀释比进行其敏感性和特异性的验证。只有在其特异性和敏感性检测符合标准后,抗体的稀释比才被接受。很多时候,没有被优化的抗体的稀释比,很难取得满意的检测效果。稀释太高,敏感性下降;稀释不够,有可能背景染色。同时,还要考虑抗体的前带效应等。一旦抗体的最佳稀释比确定后,接下来根据稀释比配备工作液。抗体稀释液对抗体的稳定性,质量有相当大的影响。所以,对抗体稀释液的评价同样非常重要,在更换供应商时需要慎重。

其它因素

        在这里我们没有讨论抗体孵育时间,孵育温度,二抗检测系统,染色液等其它因素。根据实验室的设定的标准免疫组织化学程序,一次检测一个待测的因素,其它因素应相对固定。比如同样的稀释比,在室温与37ºC比较其染色效果,室温染色会弱一些,要调节这种差异,可以通过增加抗体孵育时间。一般来说,低温、高稀释比、长时间孵育染色的片子相对比较清晰,较少背景染色,但是临床应用缺乏可操作性。安必平公司的一抗多数是在室温下(15-30ºC)孵育30分钟。

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