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免疫组化染色操作规程
 
(一)仪器设备
  (1) 18cm 不锈钢高压锅和电磁炉;
  (2)医用微波炉;
  (3)恒温培养箱箱;
  (4)冰箱(-18℃-4℃);
  (5)湿盒;
  (6)耐高温塑料切片架;
  (7)可调微量移液器;
  (8)定时器;
  (9)pH 计。

(二)操作流程

一、脱蜡和水化
脱蜡前将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤2-3小时或58℃过夜。
(1)置于二甲苯I、II、中各浸泡5分钟;
(2)无水乙醇I、II中各浸泡3分钟;
(3)95%乙醇中浸泡3分钟;
(4)85%乙醇中浸泡3分钟;
(5)70%乙醇中浸泡3分钟;
(6)蒸馏水中浸泡3分钟×2次。

注意事项
二甲苯应定期更换,否则影响脱蜡和染色效果。南方冬季室温低,应相应延长时间。

二、抗原修复
福尔马林固定的石蜡包埋组织切片

抗原热修复
1. 高温高压热修复;取一定量(约1000ml)的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0 (产品编号:LBP-IHC-06-01)或1mM EDTA PH8.0 (产品编号:LBP-IHC-06-02)于压力锅中。电磁炉大火(1800W)加热至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中(小心烫伤!)。盖上锅盖,扣上压力阀,火力调至800W, 继续加热至喷气,从喷气开始计时,约2分半钟(EDTA:2分钟)后,压力锅离开热源,1分钟后,放入水龙头下淋浴冷至压力平衡,去掉压力阀,打开锅盖冷却至室温,取出玻片,先用蒸馏水浸泡两次后用PBS缓冲液浸泡3分钟。
2. 微波热修复;取一定量(约500ml)的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0(产品编号:LBP-IHC-06-01)或0.001M EDTA(产品编号:LBP-IHC-06-02)于微波炉专用盒(容量约为600毫升)中,微波加热至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中高档(约100℃)继续处理15-20分钟;取出微波盒冷却至室温,取出玻片,先用蒸馏水浸泡两次后用PBS缓冲液浸泡3分钟。

注意
(1) 中高档或中档的选择是以通过肉眼观察微波炉内的水微微沸腾,气泡不是很剧烈,这时温度大约有98℃左右;
(2) 微波过程中,要保证组织片始终都能浸泡在缓冲液中,如发现水少,可适量补充蒸馏水至刻度,这时要注意增加浪费的时间。
(3) 在中高档或中档修复抗原切片时,亦可采用10分钟x2次来修复抗原,中间间隔30秒钟。
(4) 微波炉专用盒盖上应有孔,以防液体飞溅伤人。
3. 酶消化方法;常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37时间为10~30分钟。具体时间条件,各个实验室自行确定。

三、免疫组织化学染色

两步法
(1)脱蜡、水化;
(2)蒸馏水中3分钟×2次;
(3)抗原修复(根据一抗选用);
(4)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,或内源性过氧化物酶阻断剂(产品编号:LBP-IHC-06-09)室温封闭10分钟;
(5)PBS洗3分钟×2次;
(6)滴加正常山羊血清封闭液,室温10分钟(此步可省略);
(7)甩去多余液体,滴加一抗,室温30分钟~1小时(根据一抗使用说明);
(8)PBS洗3次各3分钟;
(9)滴加多聚合物二抗,室温15-30分钟(孵育条件请参考所用试剂盒);
(10)PBS洗3次各3分钟;
(11)DAB显色5~10分钟,(在显微镜下掌握显色程度);
(12)蒸馏水洗终止染色,苏木素复染、PBS返蓝;
(13)脱水、透明、封片、镜检。

三步法
(1)脱蜡、水化;
(2)蒸馏水中3分钟×2次;
(3)抗原修复(根据一抗选用);
(4)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟;
(5)PBS洗3分钟×2次;
(6)滴加正常山羊血清封闭液,室温10-20分钟。甩去多余液体;(此步可省略)
(7)滴加一抗, 室温30分钟~1小时(根据一抗使用说明);
(8)PBS洗3分钟×3次;
(9)滴加二抗Ⅰ试剂(Amplifier/Mouse & Rabbit IgG1)室温10分钟(孵育条件请参考所用试剂盒);
(10)PBS洗3分钟×3次;
(11)滴加二抗Ⅱ试剂(Polymer/HRP)室温10分钟(孵育条件参见所用试剂盒);
(12)PBS洗3分钟×3次;
(13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)3-5分钟。
(14)蒸馏水洗终止染色,苏木素复染、PBS返蓝;
(15)脱水、透明、封片、镜检。

­­­­­­­­­­­­­­­­注意事项
(1)每次实验一定要做阳性对照和阴性对照。
(2)阴性对照须与待测组织实验条件一致。
(3)某些情况下,阑尾组织不失为一个好的对照。
(4)一旦确定了最佳实验条件,每次只能更改其中一个参数。
(5)一种修复方法不能适合所有抗体,遇到一种抗体阴性结果时,在排除试剂质量问题后,须参考一抗说明书的最佳修复条件或询问厂家,或自行摸索最佳修复条件。
(6)若室内温度低于18℃,应将孵育盒置于37℃恒温箱。
(7)室温,除非特别说明,通常定义在25±2℃。
(8)调缓冲液的PH值时,可分别用1N的氢氧化钠或1N的盐酸。
(9)抗体应完全覆盖组织,并超过组织边缘1-2 mm ,确保抗体量足够,在孵育时间内组织区域不应干涸(干涸会导致不可逆的假阳性)。
(10)大多数抗原-抗体30分钟孵育时间足够,某些抗原敏感性低的需要1小时或4℃过夜。
(11)若片子较多,为较好的控制显色,应分批操作。
(12)DAB具有致癌性,注意自我保护。

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