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组织切片处理流程(2014新版)
样本要求
1.  适用标本类型:中性福尔马林固定石蜡包埋的组织样本切片。
2.  标本采集:采集新鲜或冷冻的针吸活检标本、粗针穿刺标本、外科手术标本。
3.  标本的固定:从取材到固定间隔不超过1小时,固定的时间以6-48小时为宜。
4.  固定液类型:10%中性福尔马林固定液。
5.  切片厚度:3~5μm之间。
6.  载玻片:防脱载玻片。
7.  保存和运送:石蜡包埋组织切片样本应室温防尘保存和运送,保存期为24个月。
仪器及材料

  自备耗材/试剂 自备仪器 提供试剂
预处理 二甲苯
70%、90%、100%梯度乙醇
恒温箱(65±5℃)
圆形玻璃染色缸
恒温水浴锅(100±5℃)
胃蛋白酶工作液
2×SSC
样品和探针同时变性 18×18mm盖玻片 镊子
橡皮胶(rubber cement)
原位杂交仪
杂交液
杂交后洗涤及复染 70%乙醇
22×22mm的盖玻片
镊子
圆形玻璃染色缸
恒温水浴锅(37±1℃)
2×SSC
0.1%NP-40/2×SSC
DAPI复染剂

检验方法
1. 玻片预处理
1.1 玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜;
1.2 取出玻片,将其放入室温二甲苯中15分钟;
1.3 取出玻片,再将其放入另一缸室温二甲苯中15分钟;
1.4 取出玻片,再将其放入室温无水乙醇中10分钟;
1.5 取出玻片,再将其放入室温100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇各3分钟;
1.6 取出玻片,再将其放入室温去离子水中3分钟,甩去多余水分;
1.7 将其放入100±5℃的去离子水中煮片25分钟(确保样本区域与容器不接触);
1.8 取出玻片,室温晾干;
1.9 将玻片正面朝上平置,在样本区域滴加200ul的胃蛋白酶工作液(以覆盖全部组织部分为准),消化5~20分钟(可通过预试验确定酶效力);
1.10 将多余液体甩去,玻片放入室温2×SSC 中3分钟;
1.11 取出玻片,再将其放入另一缸室温2×SSC 中3分钟;
1.12 取出玻片,再将其依次放入室温70%,90%,100%梯度乙醇脱水各2分钟;
1.13 取出玻片,室温晾干。
2. 样品和探针同时变性(避光操作)
2.1 从-20±5℃冰箱中取出杂交液,震荡混匀,瞬时离心;
2.2 加10μl 的杂交液到杂交区域,迅速盖上18×18mm盖玻片,轻压使杂交液均匀分布,避免产生气泡;
2.3 用橡皮胶沿盖玻片边缘封片,完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位;
2.4 将玻片放入杂交仪中,湿润原位杂交仪湿度条,插入湿条,盖上杂交仪上盖,设置“Denat&Hyb”程序,变性85℃ 5分钟,杂交37℃ 10~18小时,(若无杂交仪,可使用替代仪器,如恒温热台进行变性,电热烘箱或水浴锅进行杂交,需注意温度准确及保持杂交湿度)。
3. 杂交后洗涤及复染(避光操作)
3.1 洗涤前30分钟,将配制好的2×SSC,0.1%NP-40/2×SSC,放入37±1℃的水浴中,测量以确保温度合适;
3.2 关闭杂交仪电源,将玻片取出,轻轻撕去橡皮胶,移去盖玻片(若盖玻片难以去除,可以将其放入2×SSC中微微摇晃,以利于其脱落);
3.3 玻片放入37±1℃ 2×SSC中10分钟;
3.4 取出玻片,再将其放入37±1℃ 0.1%NP-40/2×SSC中5分钟;
3.5 取出玻片,室温70%乙醇中3分钟;
3.6 取出玻片,在暗处晾干;
3.7 室温,滴加10μl  DAPI复染剂至干燥的22×22mm盖玻片上,反转样本片,使盖玻片分别与载玻片的目标区域接触,反转后轻压,避免产生气泡,在暗处存放,待观察。
注意事项: 上述所列举试剂均在圆形染色缸中配制(每种试剂体积均为40ml),每个染色缸最多可放入5片切片。非室温溶液,在操作开始前需提前预热反应试剂至指定温度。在洗涤过程中,可间隔2~3分钟轻轻晃动染色缸,提高洗涤效果。
4. 结果分析
4.1 使用合适的滤镜,在10×物镜相差显微镜下寻找目的区域,在100×物镜下计数;
4.2 调整合适的焦距,对信号和背景有明确的概念;信号点应位于细胞内;当细胞外存在荧光信号点时,要注意与细胞内信号点区分,最好能避开该区域进行计数;
4.3 扫视几个肿瘤细胞区域,,选择一个有很好核分界的区域,要求细胞核大小一致,边界完整,DAPI染色均匀,核无重叠,信号清晰;
4.4 从选择区域的左上角开始分析,从左到右扫视,观察多个视野;
4.5 组织要求
a. 只计数发病的肿瘤组织;
b. 避免在坏死区域及核边界不清的区域计数;
c. 需要主观辨别的核不计数;
d. 跳过信号弱及没有特定信号或高背景的核计数;
4.6 转至100×物镜,调整焦距,在核的不同层次找到所有信号点;在每个核内计数信号点;调焦找到每个核内的所有信号点,计数一个区域内的两个信号,没有信号或只有一种颜色信号的核不计数,只计数每种颜色有1个或更多FISH信号的;记录观察的细胞总数(染色体正常及异常);
4.7 按照相关探针说明书设定阴性阈值。进行计数及结果判定。

 
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