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血液和骨髓样本处理步骤(2014新版)

样本要求
1. 适用标本类型:骨髓和血液样本。
2. 载玻片:载玻片。
3. 标本采集:2-3ml(肝素钠抗凝),标本量依病人具体情况而定,如再障的病人白细胞较少,应加大采集。
4. 标本保存及运输:收集后2小时内处理,标本运送建议用4~8℃。
【仪器及材料】

  自备耗材/试剂 自备仪器 提供试剂
样本处理 15ml尖底离心管
固定液(体积比3:1甲醇:冰醋酸)
离心机
移液器或一次性带刻度吸管
计时器
冰箱
0.075mol/L KCl
制片 非防脱/或防脱载玻片 移液器
显微镜
 
预处理 1mol/L的HCl
70%、90%、100%梯度乙醇
镊子
圆形玻璃染色缸
恒温水浴锅(37±1℃)
1×PBS
1%多聚甲醛/PBS
10%胃蛋白酶母液
样品和探针同时变性 18×18mm盖玻片 镊子
橡皮胶(rubber cement)
原位杂交仪
杂交液
杂交后洗涤及复染 70%、90%、100%梯度乙醇
22×22mm的盖玻片
镊子
圆形玻璃染色缸
恒温水浴锅(72±1℃)
0.3%NP-40/SSC(洗液I)
0.1%NP-40/2×SSC(洗液II)
DAPI复染剂


检验方法
1、样品处理
1.1 取外周血或骨髓2~3ml(肝素钠抗凝)2000rpm离心5分钟,去上清;
1.2 取1ml细胞加入10ml的0.075 mol/L KCl,吹打混匀,静置2分钟;
1.3 37±1℃水浴箱低渗20分钟;
1.4 加固定液1ml,吹打混匀,室温预固定10分钟;
1.5 吹打混匀,2000rpm离心5分钟;
1.6 去上清,沉淀加固定液10ml,吹打混匀,-20℃静置30分钟;
1.7 2000rpm离心5分钟,去上清;
1.8 可重复以上洗涤步骤,直至细胞沉淀洗白洗干净(此步骤不需静置30分钟)。
2、制片
2.1 取一张干净的载玻片;
2.2 重悬细胞后取3μl悬液滴加到载玻片上;
2.3 室温下晾干;
2.4 用10×物镜在相差显微镜下观察细胞密度,要求细胞无重叠,且单视野细胞数量在100~200个为宜
a) 如果细胞密度及数目合适,继续步骤3;
b) 如果细胞有重叠,则加入适量新鲜固定液稀释细胞悬液,混匀后另取3μl悬液制片,
c) 如果细胞密度低,则2000rpm离心5分钟,小心吸去适量上清液,混匀后另取3μl悬液制片,晾干,观察;
2.5 在相差显微镜下观察,如果细胞碎片太多,则需要做预处理并且选择合适的杂交区域;
注意:每个病例至少需要多制一张片,细胞滴片可置于放有无水乙醇的密闭容器中,在-20±5℃可以保存12个月。剩余的细胞悬液可以在2~8℃保存一个月,以便必要时重新制片。
3、玻片预处理(以下两种处理方法均可)
3.1 方法一:快速处理法
3.1.1 将滴好的玻片置于室温的1×PBS溶液中浸泡2分钟;
3.1.2 依次在室温70%、90%、100%的乙醇中浸泡2分钟脱水;然后取出玻片,室温晾干。
3.2 方法二:胃蛋白酶消化处理法
3.2.1 胃蛋白酶溶液配制: 400μl 1mol/L的HCl加入40ml水中,置于37±1℃水浴中,使用前加入75ul 10%胃蛋白酶,混匀,使用一天后更换。
3.2.2 玻片放入37±1℃的1×PBS中孵育5分钟;
3.2.3 取出玻片,再将其放入37±1℃胃蛋白酶溶液中消化7~15分钟(可通过预试验确定酶效力);
3.2.4 取出玻片,再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟;
3.2.5 取出玻片,再将其放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟;
3.2.6 取出玻片,再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟;
3.2.7 取出玻片,再将其放入70%、90%、100%梯度乙醇脱水各2分钟;
3.2.8 取出玻片,室温晾干。
备注:当样本难处理时,如细胞厚、杂质过多、信号较弱等,可选择方法二进行玻片预处理。
4、样品和探针同时变性(避光操作)
4.1 从-20℃冰箱中取出杂交液,震荡混匀,瞬时离心;
4.2 加10μl的杂交液到杂交区域,迅速盖上盖玻片,轻压使杂交液均匀分布,避免产生气泡;
4.3 用橡皮胶沿盖玻片边缘封片,完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位;
4.4 湿润原位杂交仪湿度条,将玻片置于原位杂交仪上,关闭原位杂交仪盖,设置“Denat&Hyb”程序,变性78℃ 2分钟,杂交37℃10~18小时(若无杂交仪,可使用替代仪器,如恒温热台进行变性,电热烘箱/或水浴锅进行杂交,需注意温度准确及保持杂交湿度)。
5、杂交后洗涤及复染(避光操作)
5.1 洗涤前30分钟,将配制好的洗液I,放入72±1℃的水浴中,测量以确保温度合适;
5.2 关闭杂交仪电源,将玻片取出,轻轻撕去橡皮胶,移去盖玻片(若盖玻片难以去除,可以将其放入1×PBS中微微摇晃,以利于其脱落);
5.3 玻片放入72±1℃ 洗液I中2分钟;
5.4 取出玻片,再将其放入室温洗液II中30秒;
5.5 取出玻片,再将其放入室温70%、90%、100%乙醇中各2分钟脱水;
5.6 取出玻片,暗处自然干燥玻片;
5.7 室温,滴加10μl DAPI复染剂到盖玻片, 载玻片目标区域朝下,轻放于盖玻片上,轻压,避免产生气泡,在暗处存放,待观察。
注意事项: 上述所列举试剂均在圆形染色缸中配制(每种试剂体积均为40ml),每个染色缸最多可放入5片玻片。非室温溶液,在操作开始前需提前预热反应试剂至指定温度。
6、结果分析
6.1 使用合适的滤镜,在10×物镜相差显微镜下寻找,在100×物镜下计数;
6.2 调整合适的焦距,对信号和背景有明确的概念;信号点应位于细胞内;当细胞外存在荧光信号点时,要注意与细胞内信号点区分,最好能避开该区域进行计数;
6.3 扫视几个细胞区域,要求细胞核边界完整,DAPI染色均匀、核无重叠,绿色和红色信号点清晰;跳过信号弱及没有特定信号或高背景的核计数;需要主观辨别的核不计数;
6.4 从选择区域的左上角开始分析,从左到右扫视,观察多个视野;转到100×物镜,调整焦距,在核的不同层次找到所有信号点;在每个核内计数信号点;调焦找到每个核内的所有信号点,计数一个区域内的两种信号,只计数每种颜色有1个或更多FISH信号的,没有信号或只有一种颜色信号的核不计数;记录观察到的细胞总数(信号数目正常及异常);
6.5 按照相关探针说明书设定阴性阈值,进行计数及结果判定。


 
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