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羊水和绒毛样本处理步骤(2014修改版)

样本要求
样本类型:
1. 新鲜羊水(≥5ml)、绒毛(≥50mg)、脐带血(≥5ml)样本,4 ℃保存,2个星期内处理;
2. 羊水培养细胞、外周血培养细胞富集后立即处理。
仪器及材料

  自备耗材/试剂 自备仪器 提供试剂
样本处理 15ml尖底离心管
0.05%胰酶
固定液(体积比3:1甲醇:冰醋酸)
15ml、1.5ml离心机
移液器或一次性带刻度吸管
计时器
冰箱
1×PBS
0.075mol/L KCl
制片 防脱载玻片 移液器
显微镜
 
预处理 70%、90%、100%梯度乙醇 镊子
圆形玻璃染色缸
恒温水浴锅(37±1℃)
1×PBS
1%多聚甲醛/PBS
1mol/L HCl
10%胃蛋白酶母液
样品和探针同时变性 18×18mm盖玻片 镊子
橡皮胶(rubber cement)
原位杂交仪
杂交液
杂交后洗涤及复染 70%、90%、100%梯度乙醇
22×22mm的盖玻片
镊子
圆形玻璃染色缸
恒温水浴锅(72±1℃)
0.3%NP-40/SSC(洗液I)
0.1%NP-40/2×SSC(洗液II)
DAPI复染剂

检验方法
1. 样本处理
1.1. 羊水样本处理:
1) 取≥5ml羊水转移到15ml的离心管(标记)中,2000rpm室温离心10分钟,弃上清,管底留约1ml;
2) 沉淀加入5ml 1×PBS并振荡混匀,2000rpm室温离心10分钟,弃上清,管底留约1ml;
3) 加入5ml的0.05%胰酶溶液,振荡混匀,37℃放置10分钟,2000rpm室温离心10分钟,弃上清,管底留约1ml;
4) 加入5ml 0.075mol/L KCl ,轻轻上下颠倒混匀,37℃孵育20分钟;
5) 缓慢贴壁加入1ml 的固定液,室温静置5分钟,2000rpm室温离心10分钟,弃上清至约1ml;
6) 沉淀加入5ml的固定液,振荡混匀,放入-20℃冰箱中至少1小时以上;
7) 2000rpm室温离心10分钟,尽可能吸尽上清。
1.2. 培养细胞样本处理:收集好的培养细胞按羊水样本处理1.1.步骤1)-2),-4)-7)进行处理,低渗时间可适当减少。
1.3. 脐带血样本处理:收集好的脐带血样本按羊水样本处理1.1.步骤1)-2),-4)-7)进行处理。
1.4. 绒毛样本处理:
1) 取≥50mg绒毛置于平皿中,用生理盐水洗净(绒毛不能含有血液、以及母体组织),然后用剪刀剪碎,越碎越好;
2) 加入10ml固定液(甲醇:冰醋酸=2:1),混匀,静置10min,2000rpm,5min离心,去上清;
3) 重复步骤2;
4) 去上清后,加入66%冰醋酸(冰醋酸:水=2:1)1-2mL(视绒毛的量定),吹打混匀1min,加入10mL固定液(甲醇:冰醋酸=2:1),混匀,2000rpm,5min离心,弃上清。
2. 制片
1) 视细胞沉淀量酌情加入固定液,吹打混匀,滴于(3μl悬液)准备好的干燥玻片上,自然晾干后于相差显微镜下观察细胞密度,10倍镜下每一视野内细胞数不少于100个,根据镜检结果用新鲜固定液调整细胞悬液浓度,重新滴片备用。
3. 预处理
胃蛋白酶溶液配制: 400μl 1mol/L的HCl加入40ml水中,置于37±1℃水浴中,使用前加入100ul 10%胃蛋白酶,混匀,使用一天后更换。
3.1. 将干燥的样本片放入37±1℃的1×PBS中孵育5分钟;
3.2. 取出玻片,放入37±1℃预热的胃蛋白酶溶液中消化5~15分钟左右(建议培养细胞/绒毛/脐带血样本消化约5分钟,羊水细胞消化约10分钟);
注意:胃蛋白酶的用量和反应时间需要根据样本类型和样本情况通过预试验进行确定。根据我方实验情况,一般来说消化处理强度培养细胞<外周血细胞,绒毛细胞<羊水细胞,也可通过处理时间的不同调整消化强度,使用同批制备的样本片按所述方法进行预试验,通常以5分钟为间隔时间。例如,分别测试消化时间为5分钟、15分钟和20分钟,完成“预处理”后,使用10×或20×物镜观察消化状态;或者直接进行DAPI复染,进行消化状态判断。
3.3. 取出玻片,放入1×PBS室温洗涤3分钟;
3.4. 取出玻片,放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟;
3.5. 取出玻片,放入室温1×PBS中3分钟;
3.6. 取出玻片,再将其依次放入室温70%,90%,100%梯度乙醇脱水各2分钟;
3.7. 取出玻片,室温晾干。
4. 样品和探针同时变性(避光操作
4.1. 从-20℃冰箱中取出杂交液,震荡混匀,瞬时离心;
4.2. 在2片干燥的18×18mm盖玻片上,分别加入10μl的杂交液I、杂交液II,将样本片翻转,使样本朝下,迅速盖上,反转后轻压盖玻片使杂交液均匀分布,避免产生气泡,作好标记;
4.3. 用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片,完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘;
4.4. 将玻片放入杂交仪中,湿润原位杂交仪湿度条,插入湿条,盖上杂交仪上盖,设置“Denat&Hyb”程序,变性78℃ 2分钟,杂交37℃ 10~18小时(若无杂交仪,可使用替代仪器,如恒温热台进行变性,电热烘箱/或水浴锅进行杂交,需注意温度准确及保持杂交湿度)。
5. 杂交后洗涤及复染(避光操作
5.1. 将玻片取出,轻轻撕去橡皮胶,移去盖玻片(若盖玻片难以去除,可以将其放入室温洗液Ⅱ中微微摇晃,以利于其脱落,取下盖玻片后应立即将样本片放入洗液Ⅰ);
5.2. 玻片放入72±1℃ 洗液Ⅰ中2分钟;
5.3. 取出玻片,放入室温洗液Ⅱ中30秒;
5.4. 取出玻片,室温70%、90%、100%梯度乙醇依次脱水各2分钟;
5.5. 取出玻片,暗处自然干燥玻片;
5.6. 室温,滴加10 μl DAPI复染剂到22×22mm的盖玻片, 反转样本片,使盖玻片分别与载玻片上的目标区域接触,反转后轻压,避免产生气泡,在暗处存放,待检。
注意: 上述所列举试剂配制在圆形染色缸中(试剂总体积40ml),每个染色缸最多可放入5片切片。非室温溶液,在操作开始前需提前预热反应试剂至指定温度

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