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尿液样本处理步骤

< 样本处理>  20×PBS(上海生工);50ml和15ml尖底离心管、离心机、移液器或一次性带刻度吸管、冰箱、计时器。
细胞保存液:2g聚乙二醇1500(Sigma P5402)溶于100ml 50%乙醇中;
低渗液(0.075mol/L KCl):准确称取5.59 g氯化钾,加入500ml纯水,充分溶解后,定容至1升;
固定液:体积比3:1的甲醇:冰醋酸,化学通风橱中配制,充分混匀;

< 制片>  防脱载玻片(武汉博士德)、移液器、显微镜。

< 玻片乙醇老化>  无水乙醇;平板加热器(上海博通BHW-05A)、24×50mm的盖玻片(上海生工)、纱布、方形盖子(长×宽≈9cm×13cm,可以同时处理4片载玻片)、镊子。

< 玻片预处理>  20×PBS(上海生工);70%、85%、100%梯度乙醇;圆形玻璃染色缸(上海生工);恒温水浴锅(37±1 oC);
胃蛋白酶溶液:400μl1mol/L的HCl加入40ml水中,置于37±1oC水浴中,使用前加入20μl 10% 胃蛋白酶(上海生工),混匀,使用一天后更换;
4%多聚甲醛:900 ml去离子水中加入500 μl1 mol/L NaOH,加热到65-70℃;边搅拌边加入40 g多聚甲醛(上海生工),持续搅拌直到溶解;冷却至室温后加入100 ml的10×PBS;用HCl调节pH到7.3;过滤除菌,2~8oC避光保存;
1%多聚甲醛(水:26ml+20xPBS:2ml+4%的多聚甲醛:10ml+1M的MgCl2:2ml)。

< 样品和探针同时变性>20x20mm盖玻片(上海生工)、镊子、橡皮胶(rubber cement)、平板加热器、杂交盒、恒温水浴锅(37±1oC)

< 杂交后洗涤及复染>20×SSC(上海生工);镊子;圆形玻璃染色缸;恒温水浴锅(37±1oC);70%、85%、100%梯度乙醇;24×24mm的盖玻片;
洗液I  (50%甲酰胺/2×SSC):16ml 纯水+ 4ml 20×SSC +20ml 甲酰胺,总体积40ml;
洗液II (2×SSC):36ml 纯水+ 4ml 20×SSC,总体积40ml;
洗液III(0.1% NP-40/2×SSC):35.96ml 纯水+ 4ml 20×SSC+ 40μl NP-40,总体积40ml。

【样本要求】

  1. 适用标本类型:尿液沉渣细胞
  2. 标本采集:新鲜晨尿
  3. 标本保存及运输:每例患者需要至少66ml尿液,按2:1的比例将尿液与细胞保存液(2%聚乙二醇1500溶于50%乙醇中)混合,总体积为100ml。置于干净密闭容器中4~8oC保存,最长一周,建议在三天内进行固定。标本长途运送建议用4~8oC,短时间内常温亦可。未添加保存液的新鲜尿液必须在2小时之内做处理。

【检验方法】
1样品处理
1.1 将100ml尿液及细胞保存液的混合物(新鲜尿液可以不加保存液)分成两份,加入50ml的离心管中,常温下以离心力1500×g 离心15~20分钟,如沉淀量极少或未见沉淀则重复此步骤;
1.2 倒去上清,剩余约1~2ml,小心不要碰到沉淀;
1.3 各管沿管壁加入1ml 1×PBS, 用移液枪轻柔吹打混匀,将2管同一来源的尿液沉渣合并至新的15ml的离心管中,原管中分别再加入1ml 1×PBS洗涤离心管, 全部洗液转移到新的15ml的离心管中。加入1×PBS, 使终体积为10ml;
1.4 1500×g室温离心10分钟;
1.5 弃去上清,剩余约0.5ml液体,小心不要碰到沉淀;
1.6 用移液枪或吸管吸取1ml低渗液(0.075mol/L KCl)沿管壁小心加入, 轻轻吹打混匀,将沉淀吹打至无明显块状物, 再吸取1ml 低渗液沿管壁小心加入,轻轻混匀。 稍静置后加入低渗液使终体积为10ml,37±1oC静置15~20min(低渗时间过长可能会破坏细胞结构,影响杂交检测结果,第一批样本检测前需对低渗时间进行预试验);
1.7 轻拍离心管底部混匀,缓慢小心加入2ml新鲜配制的固定液(3:1的甲醇:冰醋酸),边加边用移液枪或吸管小心轻柔吹打,注意要使固定液与低渗液充分混合均匀; 室温静置(预固定)10min;1500×g 离心5分钟, 弃上清, 缓慢小心加入5ml 新鲜固定液,用力吹打2分钟,将团状沉淀吹散至无明显块状物。
1.8 离心管放入-20±5oC冰箱中静置至少30分钟(放置过夜或者更长时间均可以,最长不超过10天);
1.9 1500×g离心5分钟,小心去除上清。(如果细胞沉渣量非常少,为避免进一步丢失,直接到第1.12步);
1.10 加入5ml新鲜固定液,用移液枪或吸管用力吹打混匀;
1.11 1500×g离心5分钟。重复步骤1.9和1.10两次;
1.12 离心结束后,如果细胞沉渣量较少(几乎不可见),尽可能小心地除去上清,剩余约100μl;如果细胞沉渣较多,尽可能地去除上清,依沉淀的量加入0.5~1ml的新鲜固定液;
1.13 继续制片的步骤。

2、制片
2.1 取一张干净的载玻片;
2.2 重悬细胞后分别取3μl,10μl和30μl悬液滴加到载玻片上的不同位置,注意不要重叠;
2.3 室温下晾干;
2.4 用20×物镜在相差显微镜下观察三个区域的细胞密度,记录细胞没有明显重叠,且数量在100~200个以上所加的细胞悬液量;

  1. 如果细胞密度及数目合适,继续步骤2.5;
  2. 如果滴加30μl悬液的区域仍然细胞数目太少,另取30μl悬液重复滴到该区域,晾干,观察;
  3. 如果滴加3μl悬液的区域仍然细胞数目太多,用新鲜固定液稀释细胞悬液,重复步骤2.1~2.4;
2.5 另取一张干净的载玻片,分为左右两个区域,分别滴加适量的细胞悬液;
2.6 在相差显微镜下观察,如果细胞碎片太多,则需要做预处理并且选择合适的杂交区域;
注意:每个病例至少需要多制一张片,细胞滴片可置于放有无水乙醇的密闭容器中,在-20±5oC可以保存一年。剩余的细胞悬液可以在2~8oC保存一个月,以便必要时重新制片。

3玻片乙醇老化
3.1将热台加热到95±1oC;
3.2 从1%HCL(无水乙醇配制)中取出24×50mm的盖玻片,擦干备用;
3.3 取一块折叠为方形的4~8层纱布,浸透无水乙醇;
3.4 在载玻片的杂交区域上各滴加160μl的无水乙醇;
3.5 轻轻盖上24×50mm的盖玻片,轻压紧;
3.6将载玻片置于95±1oC预热的热台上,盖上浸透了无水乙醇的纱布(完全覆盖载玻片),再盖上事先准备好的方形盖子(完全覆盖载玻片),计时2分钟;
3.7 从热台上去除盖子、纱布,取下载玻片,轻轻去除盖玻片,继续预处理步骤。

4玻片预处理
4.1 玻片放入37±1oC的1×PBS中孵育5分钟;
4.2 取出玻片,再将其放入37±1oC胃蛋白酶溶液中消化7~15分钟(需通过预试验确定酶效力);
4.3 取出玻片,再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟;
4.4 取出玻片,再将其放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟;
4.5 取出玻片,再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟;
4.6 取出玻片,再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟;
4.7 取出玻片,再将其放入70%、85%、100%梯度乙醇脱水各3分钟;
4.8 取出玻片,室温晾干玻片;
4.9 继续杂交过程。

5、样品和探针同时变性
5.1 从试剂盒中取出杂交液I和杂交液II,震荡混匀,瞬时离心;
5.2 分别加10μl的杂交液I(用于样本片的左侧区域杂交)和杂交液II(用于样本片右侧区域杂交)至干燥20x20mm盖玻片上,将样本片翻转,使样本朝下,迅速盖上,反转后轻压盖玻片使杂交液均匀分布,避免产生气泡,作好标记;
5.3 用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片,完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘;
5.4 将玻片放在78±1oC的热台上,变性2分30秒(注意:使用前必须确认温度准确);
5.5 迅速将玻片放入预热的杂交盒中,避光,37±1oC孵育过夜(约16小时);
5.6 继续杂交后洗涤步骤。

6、杂交后洗涤及复染
6.1 洗涤前30分钟,将配制好的洗液I, 洗液II, 洗液III,放入37±1oC的水浴中,测量以确保温度合适;
6.2 取出孵育过夜的杂交盒,小心去除橡皮胶水和盖玻片;
6.3 迅速将玻片放入提前预热的盛有洗液I的染色缸中,37±1oC洗涤15分钟,一次最多洗涤4张玻片;
6.4 取出玻片,再将其放入盛有洗液II的染色缸中,37±1oC洗涤15分钟;
6.5 取出玻片,再将其放入盛有洗液III的染色缸中,37±1oC洗涤5分钟;
6.6 取出玻片,室温70%、85%、100%梯度乙醇依次脱水各3分钟;
6.7 取出玻片,垂直放置于纸巾上,在暗处晾干;
6.8 分别滴加10μl DAPI复染剂至两张干燥的24x24mm盖玻片上,反转样本片,使盖玻片分别与载玻片的左右两个目标区域接触,反转后轻压,避免产生气泡,在暗处存放,待观察。
 

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