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荧光原位杂交(FISH)课题切入点

 
    随着人类全基因组测序的完成,人们越来越清楚地认识到在疾病的发生发展中各种基因的作用及调控机制。传统的形态病理诊断已不能充分满足现代医学的发展,细胞组织形态及在分子水平上对各种疾病的病理综合研究是现在及未来医学的发展所趋,越来越精细的研究使个体化诊断及治疗更为有效及可靠。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)的出现让形态及分子结合的病理诊断及治疗得以快速发展。FISH技术是在细胞遗传学水平上检测染色体及基因数目及结构异常的一种分子生物学技术。其基本原理是利用标记了荧光素的核酸作为探针,按照碱基互补原则,与待检样本中与之互补的核酸经过变性-退火而形成杂交双链核酸,然后通过荧光显微镜来检测和分析。
        由于FISH技术具有直观、快速、敏感性高和方便灵活等特点,目前已经广泛应用于临床的肿瘤遗传学及各种基因相关疾病的分型与个体化治疗等多个领域。在国际医学市场上,其发展不过十年左右。FISH技术在发达国家已经得以广泛应用于多种领域的临床研究。目前为止,以FISH技术为研究内容的SCI文章已达四万六千多篇,且近年来的文章数量呈指数增长趋势。FISH相关文章的指数增长提示以这一技术为主导的分子病理学研究(个体化诊断及靶向治疗)正处于爆发时期。目前与各种实体肿瘤和血液肿瘤相关的FISH探针有接近100种,包括膀胱癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、软组织肉瘤、前列腺癌、甲状腺癌等多种实体肿瘤;白血病、骨髓增生异常综合症(MDS)、多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤等多种血液肿瘤。在欧洲国家,这些肿瘤探针已显示出巨大的临床应用价值和学术价值,2001年以来每年以2000多篇的文献数量增长。但是,国内这方面的研究才刚刚起步,2005年以来每年仅以300多篇的数量增长,且影响因子远远比不上国外同行。对医院科室而言,用FISH产品来结合自己医院专科特色开展临床课题的申请及研究,是一个非常不错的切入点。以下就部分产品的研究切入点做个简单介绍。

一:乳腺癌。
1:HER-2。
        HER-2是人类表皮生长因子家族中的一员。人类表皮生长因子信号通路的异常在多种肿瘤中其中重要作用。目前应用最为广泛的是在乳腺癌中指导靶向药物赫赛汀的使用。HER-2的临床应用已有十年的数据支持,但是目前仍有空间可供课题切入:

    1.1  17号染色体非整倍体(单倍体和多倍体)与HER-2 IHC2+的关系、与HER-2是否扩增的关系、及与乳腺癌患者预后的关系研究。a)非整倍体对HER-2 IHC2+的影响的文章主要集中于2007-2009年,日本学者也报道了部分数据,但是中国方面的数据相对而言较为缺乏(引文1-7)。b)目前17号染色体非整倍体的研究偏向于多倍体,而对于17号单倍体对患者预后及治疗的研究较少,有文献报道单倍体的比例约5%(引文8),且这部分患者的预后较差,但是临床的数据很少。c)非整倍体与乳腺癌患者的治疗选择、预后(肿瘤级别、激素受体是否阴性、存活时间等)的关系在不同文献中的结果不一(引文7),数据缺乏横向比较性。

    1.2  HER-2扩增在其他肿瘤中的治疗意义。2011年FDA已批准赫赛汀用于具有HER-2扩增的晚期贲门胃癌病人的治疗(基于ToGa临床试验的数据)。但是,在胃癌中的研究与乳腺癌有些不同(引文9):a)乳腺癌中90%以上HER-2基因扩增的患者出现HER-2蛋白高表达,而胃癌中却不到80%(ToGa试验),也就是说在胃癌中具有较高的肿瘤异质性。b)胃肠交界处HER-2扩增的比例比胃其他部位的要高(约30% vs 15%)。c)赫赛汀在胃癌中的辅助治疗具有像乳腺癌中的应用前景,但刚刚开始需要大量数据补充。

    1.3  除了乳腺癌和刚刚开始的胃癌外,我们还需注意到人类表皮生长因子信号通路的异常存在与多种肿瘤,如已有报道胃癌/小细胞肺癌/卵巢癌/前列腺癌/结直肠癌/唾腺癌/等肿瘤(引文9)。在这些肿瘤中的临床意见及治疗前景是否与乳腺癌和胃癌的类似?这些都需要进一步的数据支持。

    1.4  组织片处理方法的技术研究。比如用环保试剂脱蜡及二甲苯脱蜡对FISH结果的影响;高温煮片和硫氰酸钠化学处理对细胞形态和FISH结果的影响;蛋白酶K及胃蛋白酶对组织的影响差异;不同洗涤条件的结果差异;组织固定时间长短对杂交的影响等。

2:TOP2A。
        拓扑异构酶IIa基因(TOP2A)的位置与HER-2相邻,都处于17q12-21的肿瘤热点区域。TOP2A基因有扩增和缺失两种异常形式。TOP2A基因扩增的患者可指导使用蒽环类化疗药物的治疗;TOP2A扩增患者在使用CEF化疗方案治疗时能降低复发风险和死亡风险;而对TOP2A基因无变异患者,CEF和CMF的疗效无明显差别;HER-2阳性伴有TOP2A基因扩增的患者术前用含蒽环类药物的新辅助化疗方案敏感性高。而TOP2A基因缺失的患者预后差,且常常伴随着HER-2基因缺失(引文10)。目前FDA已批准丹麦的TOP2A FISH试剂盒用于临床检测,但是相对于HER-2而言,TOP2A的临床检测非常匮乏。这可能与缺少大型药厂的临床推广及蒽环类药物具有较大的毒性而导致临床使用较为谨慎有关。但是,在学术上,针对HER-2与TOP2A的关系而开展的研究不多,比如TOP2A扩增或缺失与HER-2扩增的相关性、TOP2A异常患者的病理特征等。并且,用多色FISH针对这两个基因进行检测有很好的临床应用前景。比如17号着丝粒标记青色、TOP2A标记绿色、HER-2标记红色,可在同一样本、同一细胞中同时检测这两个基因,从而可以降低临床检测费用(引文11)。

3:FISH产品在三阴乳腺癌中的应用。
        2012年的一篇nature文章明确提出乳腺癌可分为十种分子亚型,每种亚型有独特的病理特征和治疗手段。三阴乳腺癌是其中一种,自2005年被正式命名(引文12),即雌激素受体(ER)阴性、孕激素受体(PR)阴性和HER-2阴性。目前三阴乳腺癌的相关文献有500多篇,国内只有为数不多的几十篇。三阴乳腺癌患者预后较差,且没有标准的治疗方案。目前,已有多种针对特异基因的靶向药物开始尝试运用于三阴乳腺癌中的治疗(引文13)。如针对EGFR基因扩增的靶向药物(易瑞沙、特罗凯等)、针对TOP2A基因扩增(蒽环类药物)、针对c-MYC基因(独立的预后判断因子)检测。如果拟对三阴乳腺癌选用这些靶向治疗方案,首先需要检测这些基因是否异常,而这些靶标都可用FISH方法来检测。

4:雌激素受体基因(ESR1)的临床应用。
        2007年的一篇nature genetics文章吸引了业内人士的注意(引文14)。针对雌激素受体基因(ESR1)的检测比目前已广泛应用于临床的雌激素受体蛋白(ER)检测更为有效。ESR1扩增的乳腺癌患者其ER都高表达,且ESR1扩增的比例越高,其无病生存期和总生存期越长。ESR1扩增的患者用雌激素药物他莫昔芬治疗的疗效显著好于ESR1不扩增患者。更为重要的是,ESR1基因在一些癌前病变的乳腺患者中也存在扩增,提示其异常可能是发展为肿瘤的早期事件,对模棱两可的不好判断是否为癌的乳腺疾病也起着辅助诊断作用。这篇文章一出来,第二年就有12篇以ESR1为靶标在多种肿瘤的研究数据发表(引文15),可见其在学界的受重视程度。2012年的一篇综述总结说未来针对ESR1的研究就像现在的HER-2那样会应用广泛(引文16)。而中国,包括东亚人种,对这个基因的研究还没见报道。
 
二:膀胱癌
        在美国,Vysis公司的膀胱癌FISH多靶标检测试剂盒(3、7、17、P16)已于2001年被FDA用于临床。相对目前的金标准膀胱镜和尿脱落细胞检查而言,利用尿脱落细胞进行分子水平的FISH多靶标检测具有更高的灵敏度,由尿脱落细胞检查的40%提高至80%以上,且特异性达90%。FISH检查可用于分辨血尿的良恶性。并且,基于分子的FISH检测可比形态学异常提前发现膀胱癌。还有,膀胱癌术后复发率较高,术后定期进行FISH检查可监测患者的预后。前两年卫生部已经牵头多家医院开展较大规模的膀胱癌FISH临床检测课题,但数据还不够充分。比如可有一些切入点:a)血尿FISH异常的比例及与临床病理检测结果的符合率。b)FISH结果对低级别尿路上皮癌和高级别尿路上皮癌的符合率和漏诊原因分析。c)各靶标异常与肿瘤分期、分级、预后、复发的关系。d)膀胱癌样本复杂性(如细胞量少、结晶、炎症细胞)对FISH结果准确性的影响。e)用液基细胞学样本处理方法辅助去除尿杂质再进行FISH实验的条件摸索。

三:宫颈癌
        目前宫颈细胞学筛查的广泛应用和HPV检测已使宫颈癌的发病率和死亡率大幅度下降,但目前的筛查程序仍存在一定的局限性。对于年轻女性来说,轻度细胞学异常很常见,且大多数会自然转归;HPV感染可能只是短暂的,有可能自然转阴。更为重要的是,细胞学筛查不能很好地辨别ASCUS/LSIL(组织学CIN)患者是否进展。CIN发展为宫颈癌是一个长期的过程,早期诊断和恰当的治疗完全可能将其阻断在CIN或早期癌阶段,并彻底治愈。然而,并非所有的CIN病变都进展为高度病变,而目前采用的基于形态学诊断的方法有时很难将CIN与非瘤病变、不同级别的CIN准确地鉴别出来,从而导致过度治疗或治疗不足。因此,需要其他手段辅助CIN的诊断。宫颈细胞癌变过程中几乎都伴有3号染色体长臂及端粒酶RNA基因(TERC)的扩增。TERC基因的扩增可阻止细胞凋亡,导致肿瘤发生发展。充分数据表明,随着宫颈病变级别增加,TERC基因扩增的阳性率也随着增加。当病人细胞学和病理学检查不能明确病情为CIN I还是CIN II时,如果TERC基因存在扩增,则提示病人为CIN II以及以上级别的几率为90%,且有癌变的可能。所以,用FISH方法检测TERC基因扩增有助于宫颈癌的筛查及早期诊断,并且可以辅助明确癌前病变的病理分级,从而提示临床选择合理的治疗方式,避免过度治疗或治疗不足。液基细胞学+HPV检查+TERC检测的组合套餐可把宫颈病变的准确性和特异性提高至最优水平。前两年卫生部牵头80家国内医院开展TERC在宫颈癌中的应用研究,样本总数高达6000例以上,结果已于2010年发表(引文17)。但是,目前仍需数据补充,比如,a)TERC在我国人群细胞学检查ASCUS/LSIL/HSIL/ASC中的异常比例(或组织学CIN I/II/III)。b)宫颈癌TERC异常在我国种族中的差异。c)TERC基因异常与年龄的关系。另外,近年来发现c-MYC是宫颈癌预后的一个重要独立指标,用多色FISH联合检测TERC和c-MYC和CSP3对宫颈病变及预后的判断为更为有利的切入点(引文18)。

四:肺癌
        EGFR是否变异(基因扩增及点突变)对靶向药物(如易瑞沙、特罗凯)的使用起着重要提示意义。2000年以来用FISH方法检测EGFR是否扩增的临床数据非常丰富,并且EGFR扩增的拷贝数越高,用药反应率也随之增加。但是,2005年以后发现EGFR点突变对用药的反应率比基因扩增更高。随着2010年NCCN肺癌治疗指南中明确提出EGFR点突变对指导用药的意义,基于点突变的检测在临床上应用也铺展开来。目前,似乎基于FISH的EGFR检测变得不再适用,这种观点逐渐铺展开来。但是,2011年Annals of Oncology的一篇社论对EGFR FISH检测是否有存在的必要展开了讨论(引文19)。指出最重要的一点,点突变应用的作用是提示患者的用药反应率比FISH更为准确(80% vs 60%)。但是,点突变并不能提示靶向用药能否延长患者的总生存期,而FISH高扩增患者却能提示延长。并且,FISH基因扩增的人群与点突变人群并不完全覆盖,如果只做点突变检测,会遗漏掉FISH扩增的这部分获益人群。如果考虑到EGFR阴性而需要做ALK检测的话,而后者也需要用FISH,所以,最好是点突变和FISH同时检测。另外,从技术角度上看,点突变涉及的步骤较多、经PCR扩增可能存在污染、需要标准化的实验室或验证、DNA质量对结果影响大、需要组织较多等因素,不如FISH检测那么简单和直观和结果可靠。所以,EGFR FISH检测仍有存在的必要。而有条件的实验室可展开两种技术方法的对比研究。

五:血液病
        血液肿瘤(如白血病、骨髓增生异常综合症(MDS)、多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤)的相关基因异常对患者有着重要的预后判断提示,特别是多种组合探针的综合评估。血液类的FISH探针高达50种以上,这些探针的临床应用数据主要集中于1997-2003年的文献上,如BLOOD和Leukemia杂志,但是相应探针的临床数据量比较小,很少涉及东亚或中国人群。并且,这方面国内的大型课题非常少,有丰富样本资源的血液科、血液研究所可与我们公司合作进行相应探针或组合试剂盒的临床应用评估,这将是非常不错的切入点。

六:其他肿瘤
        目前已经商品化的各种FISH基因探针高达100种,覆盖各种实体肿瘤和血液肿瘤。FISH探针的主要意义为指导用药(靶向药物、化疗药物)、鉴别诊断(如膀胱癌、前列腺癌、软组织肉瘤、淋巴瘤、甲状腺癌、宫颈癌等)、预后判断(如血液类组合探针)。这些探针的临床数据、特别是国内数据才刚刚起步,需要大量补充。


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