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免疫组织化学染色常见问题及其处理
 

        当免疫组化染色没有出现预期结果时,应系统地查找原因,而每一次只能排除一种可能的原因。
 
对照/标本无染色


 1. 确认是否忽略了应该加的某种试剂,包括一抗、二抗、三抗及底物等。
 2. 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入,是否孵育了足够的时间。
 3. 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体,以及所用的检测系统是否和一抗匹配,这一点是非常重要的。比如,如果一抗是兔来源的抗体,二抗一定要用抗兔的二抗来匹配;或一抗是小鼠的IgM一抗,二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM(不是IgG)二抗。
 4. 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
 5. 检查抗体的有效期和保存条件,尤其是标记了酶或荧光素的抗体,现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价。
 6. 检查标本的储存条件,最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
 7. 检查色原/底物溶液,最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中,如果底物发生预期的颜色变化,则可排除底物的因素。需要注意的是,有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完,否则会失效。
 8. 检查冲洗液是否和反应试剂匹配,溶液的pH值很重要,与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
 9. 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
 10. 检查实验过程中标本有无干燥,试剂用量是否正确,有无应用湿盒。
 

弱阳性
 
   如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性,除了考虑上述因素外,还应考虑:
 1. 标本的固定方式,不当的固定方式或固定时温度过高,都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
 2. 不适当的抗原修复方式,由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用,必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法,至于使用哪一种方法,应参照生产厂家的说明,同时结合标本的具体情况而定。
 3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围,但是由于使用者的标本来自各种组织,处理过程也不尽相同,所以应参照使用范围,对所使用的一抗进行梯度测试,找出最佳的使用浓度。
 4. 切片上遗留了过多的冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
 5. 孵育时切片是否放置水平,否则会导致抗体流失。
      如果阴性对照没有反应,阳性对照反应良好,而标本弱阳性,则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同/脱水不当等原因所致。处理方法:对照切片和实验组织的固定于脱水必须一致。如果发现是由于固定不当导致实验组织的抗原浓度低,可提高抗体浓度,延长孵育时间,或提高反应的温度。
 
非特异性染色

 
 1.  是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是,并不是每一种组织均需要进行此步骤,但对于内源性酶或生物素丰富的组织,如肝脏、肾脏等,需考虑此原因。处理的方法为:
 A.  灭活内源性过氧化物酶:3%甲醇双氧水孵育组织切片10分钟,能有效灭活大部分过氧化物酶。需要注意的是,高浓度的双氧水会破坏少数的抗原,此时应该把双氧水孵育放在一抗孵育之后或降低双氧水浓度至0.3%。
 B.  灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将L - 咪唑(24mg/m1)加入底物液中,并保持pH值在7.6~8.2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶,对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶,可用50mmol/L的酒石酸抑制。
 C.  饱和处理内源性生物素:消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素,以饱和内源性生物素,使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟,PBS清洗15分钟后即可染色。或采用现在流行的非生物检测系统——多聚合物/酶/抗体检测系统。
 2. 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清,用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片,以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白,如牛血清白蛋白也常应用。另外,取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭,效果也不错。
 3. 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
 4. 一抗的使用浓度是否过高。处理的方法为:梯度实验重新确定最佳稀释度。
 5. 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐,这亦有利于减低背景着色,通常0.05mol/l Tris—HCl,0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法,溶液内加入Tween20,效果更佳。特殊标记时,试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
 6. DAB的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色,使用浓缩型DAB试剂盒时,请严格按照说明书标明的滴加顺序操作,注意校正蒸馏水的pH值,以确保实验结果的正确性;粉剂DAB溶解时,常有一些不溶性颗粒,这些颗粒须经过滤除去,否则可能沉积于切片组织上,产生斑点状着色。另外,DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上,因此需将DAB保存于避光干燥处,现用现配,临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
 7. 标本染色过程中是否曾经干涸,否则会造成边缘部的非特异性染色。
 8. 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
 
  对于免疫组织化学后切片的评判,要做到准确、客观,必须具备以下几个条件:
 
 1. 主要细胞阳性。即靠其作出诊断的病变细胞,在一张切片中,有各种各样的细胞,有正常的和病变的,有的切片是以病变的细胞为主,有的则是正常的或炎症组织细胞为主。如鼻咽部粘膜组织的活检,其表面有一层粘膜上皮,CK和EMA标记时,它可显示出很强的阳性,但这种不能作为诊断的依据,必须认真地观察上皮粘膜下的组织,这个地方才可见到有病变的组织或细胞。如在这地方出现细胞的异常,即细胞大小不一,核染色深或者排列紊乱,加上CK和EMA阳性,即可作出阳性的诊断,有条件的还必须作一张嗜银纤维的染色,这对于诊断很有帮助,如癌细胞周边可有大量嗜银纤维围绕,癌组织或细胞中没有嗜银纤维的存在。
 
 1.1  阳性细胞的阳性物定位要准确,不能模棱两可,似是而非。
        阳性细胞所出现的阳性物,无非是在细胞核、细胞膜和细胞浆,但不管在什么部位都要定位准确。例如ER和PR,它们的阳性物是在细胞核,如果在细胞浆中见到棕黄色的反应物,也应判为阴性。因为具有生物学效应的细胞核内受体才是真正的受体,又可称为Ⅰ型受体;而细胞浆内的所谓受体,实际上是一种能与性激素结合的大分子蛋白,其功能只是将性激素从胞浆转送到核内的载体作用,实非真正受体,故也可称为Ⅱ型受体[9]。至今为止,于核内阳性的抗体有:ER, PR,P53, Bcl-6,BRCA1,HBcAg,HCV,ki-67, P16,P21,P63,PCNA,ToPoⅡ,在判断核内阳性时,除了核内有真正的阳性外,其余都应判为阴性。
 
 1.2  每批检测的切片,都须设有准确的阳性、阴性或空白对照片,以确保检测病例的准确性和可靠性。
        阳性对照片是用已被免疫组化确定为阳性的病例或者选用某些组织一定含有的抗原(如标记CK时,上皮组织表达一定阳性)作为阳性对照片,于每天的免疫组化染色中与待检片一起进行染色,最后的结果阳性片一定阳性,以其为标准,来评判每一例切片。在每一批免疫组化的检测中,并非所有的切片都是阳性,也并非所有的切片都为阴性,有了正确的阳性对照片,对于无表达的阴性片,就能够确切地、干脆地作出阴性的判决。阳性对照片的设立,可以排除假阴性。
在设立阳性对照片时,应以每天新鲜切片的病例为最好。以往,有人为了贪图方便,一次性切了大量的切片贮备着,作为每次使用的阳性对照片,经实验证明:这种方法不可取,因为切片切好后长期存放,会使切片上的抗原受到破坏,随着时间的延长,切片上的抗原会逐步消失,最后阳性片也呈阴性。所以,切好后的切片短时间内(小于3个月)存放于4℃冰箱中,脱蜡前可放入烤箱(58℃)10分钟即可。
 
 1.3  可以利用待检组织设立阳性内对照。
        为了节省抗体、人力和物力,可以正确地使用待检组织对照的方法。在一批待测片中,如有确定的欲测抗原,就不需专门设立一张阳性对照片,而可利用欲测切片上的必定阳性组织来进行对照。如检测B细胞或T细胞时,有淋巴结的切片,这种情况就可以不设阳性对照片,阳性对照片的设立,一是排除待检片中的假阳性,假阴性病例;二是检测操作中有没有存在技术方面的问题,如果操作不当,就不可能得到阳性结果或出现假阴性。现在各单位,每天检测的项目都很多,如果每项都设立一张对照片,是不可能的,因此,要准确地选择对照片。
 
 2.如何解释免疫组织化学染色后切片中许多不该着色的成分都着色的问题?如标记淋巴组织细胞时,有的上皮细胞也着着,标记CK时,肌层组织也着色,这究竟是什么原因呢?
 
 2.1 在各种组织中,都存在着各种酶,一般认为,酶蛋白和辅助因子单独存在时,它们都没有活性,因而也就没有催化底物这一功能。但是,当它们结合在一起时,就具备了酶的特有性状,催化底物的作用。在检测的各种组织中,往往就存在上述的情况。当加入标记的抗体后,这些抗体中都含有与同种类属相应的酶蛋白或辅助分子,当它们与撒落于各种组织中的酶蛋白或辅助分子结合后,就可以产生效应,催化底物,并产生不溶性的棕黄色。检测的切片含有各种成份,如上皮、肌组织和神经、间质等待。当测其中的某一项目时,其它成份由于受到影响,便会产生各种不同的反应。如检测CK时,由于含有上皮成份的组织在固定前没及时处理好,造成这些组织的变化,将部分的抗原撒落扩散到周边组织,周边组织可将这些抗原吸收,吞噬或吸附,因而在最后显色时就可以被显示出来。
 
 3.膜性表达的抗体,为什么会出现膜性的加宽、加厚,并出现浆中表达的现象,这可能与下面的情况有关:
 
 3.1  抗原的融合,导致膜性抗原的膜加大加厚,组织由于固定不及时,抗原向两边扩散,加宽了膜性的表达,就如同我们写字时有润纸的现象,当下笔时,写下的墨水向两边浸润一样。
 
 3.2  切片的原因导致误认为细胞浆中的表达。
        对于细胞密集的组织,由于其排列不在一平面上,当切片时,有的细胞被拦腰切断,这种有完整的细胞膜,有的被部分切断,细胞膜则仅有片块状,有的则切到盲端,而这盲端遮盖了另一细胞的断面,如同另一细胞的浆内物质,这种现象可将其称为“切片现象”。
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