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免疫组织化学双重染色技术及其应用
      
       IHC在临床病理和研究中的应用日益广泛。在有些情形中,组织样本稀少或是研究者想要在同一切片中获取两个甚至两个以上的抗原表达信息,这就需要在同一张切片中进行双染或多重染色。
      IHC双染技术是在同一组织中检测两个抗原的表达情况和相互关系,如果两个抗原在细胞的相同部位表达,则IHC的颜色将会是两种色原的混合;如果两种抗原在同一细胞的不同部位表达(胞核-胞浆,胞核-胞膜,胞浆-胞膜),用两种不同的显色系统检测,在光学显微镜下可以明显地判断出两种染色的区别[1]。
 

双染的应用优势
       由于在同一组织切片中可以观察到两种不同的抗原表达,因此,免疫组织化学双染较单一染色有其优势的一面。1)明确细胞的状态:通过细胞标记物和细胞活化标记的复合定位,可以更准确地区别静止(休息)状态的细胞和活化细胞。2)节省组织或样本:对于稀少的组织样本,双染能充分利用有限的样本提供更多的信息。3)血液病理应用双染决定Kappa和Lambda的比例,可协助判断淋巴瘤及分类。4)充分利用抗体组合进行双染,可获取更多有价值的诊断信息。
 

双染的方法
       同时双染:同时孵育两个来源于不同种属的一抗,如一抗是分别来源于鼠,兔或鼠,羊。由于很多医院已经习惯上用通用型的二抗,多数的一抗是来源于兔和鼠,同时双染的应用受到限制[2]。
      序贯双染:可用于一抗来源于同种属的抗体如鼠与鼠或兔与兔,在第一轮染色完成后再进行第二轮染色[2]。
 
       最适合于双染的色原:尽可能地选择肉眼颜色对比明显的颜色如红-蓝,蓝绿-红,红-棕,复染可用苏木素。
 
技术关键
       同时双染需要选择用于双染的一抗来源于不同种属的抗体,如一种为抗鼠抗体,那另一种最好是抗兔抗体、抗羊抗体和与之相应的二抗。由于多数应用于临床的一抗来源于鼠、兔,而二抗多数是来源于羊的通用型抗鼠兔,所以适用于这种方法可选用的抗体受到极大的限制。
       来源于同种属的一抗在进行序贯双染时,防止两次抗原抗体之间的交叉反应非常重要。有文献报道第一轮染色的色原是DAB的话,DAB可以遮蔽第一轮的免疫试剂,防止其交叉反应。所以第一轮抗体的稀释比非常重要,如抗体滴度过高,DAB不能有效遮蔽,会引起交叉反应。同时如果两种染色的抗原性太近的话,DAB可能会封闭第二轮抗体的抗原。序贯染色不主张根据混合染色判断两种抗体的复合定位。第一轮一抗的稀释比非常重要,建议第一轮染色用高稀释比的一抗与高敏感性的二抗,第二轮的一抗用浓度高的抗体与相对低敏感性的二抗,如此一来即使第二轮二抗与第一轮染色中的抗原抗体复合物有交叉反应,其交叉反应后的影响效果可以尽可能地缩小。此外,在第一轮染色后用Glycine和SDS配制的抗原抗体洗脱液,在50℃的温度条件下孵育1小时,可以将第一轮染色中多余的抗原抗体复合物洗提干净,避免交叉感染[3]。
        所以在确定是否进行双染时,首先确定用于双染的抗体类型,细胞定位,色原。在进行双染之前最好进行单染确定其适合双染的稀释比。选择双染的色原确保双染后的颜色对比鲜明。但如果双染的目标细胞在细胞定位是相同的,双染后的颜色会出现两种颜色的混合,目前比较确定的颜色混合是红与蓝混合后成棕紫色;青绿色与红色混合后成蓝紫色。
       双染在临床的应用仍然不广泛,但可以预见其未来的前景是广阔的。40年前IHC在临床的应用曾被认为是大可不必的,但今天的IHC应用已成为临床病理的重要工具。许多转录因子,趋化因子,细胞因子,干细胞标记有非常广泛的染色模式,染色众多的细胞。单一IHC染色也许意义不大,但结合这些标记物进行双染,多染,得出的信息对诊断,治疗,预后及其重要。
 
序贯双染操作步骤:
一、脱蜡和水化 (略)
二、第一抗体的染色
1、滴加3%H2O2,室温孵育10 min,蒸馏水冲洗3 min×3次;
2、滴加一抗, 室温孵育30min;
3、使用含有0.02%吐温20的 TBS,冲洗3min×3次;
4、滴加二抗LBP-Vbright II A液,室温孵育10 min;
5、用TBS冲洗3 min×3次;
6、滴加二抗LBP-Vbright II B液,室温孵育10 min;
7、用TBS冲洗3min×3次;
8、DAB染色3min;
9、切片放入50℃蒸馏水或50℃的Glycine-SDS 缓冲液(pH2)浸泡1小时,洗脱第一次过剩的抗体防止与第二次染色中的二抗发生交叉反应。
三、第二抗体的染色
10、滴加一抗,室温孵育30min;
11、使用含有0.02%吐温20的 TBS,冲洗3min×3次;
12、甩去TBS液,滴加LBP-AlkBright II A液,室温下孵育10分钟;
13、用TBS冲洗3 min×3次;
14、甩去TBS液, 滴加LBP-AlkBrightII B液,室温下孵育10分钟;
15、用TBS冲洗3 min×3次;
16、滴加显色剂(固红)显色15min;蒸馏水浸泡终止反应。
17、苏木素复染;蒸馏水返蓝;脱水;透明;封片。

双染抗体示例
P63&P504S:前列腺癌

        P63标记基底细胞,可以用于识别已发生恶变的腺细胞是否浸润。P504s在正常和良性的前列腺组织中表达较低而在恶变的细胞中表达增强。所以用p63标记正常和良性前列腺腺体的肌上皮细胞,用p504s标记发生恶变的肿瘤细胞进行双染,可以判断肿瘤细胞是否发生浸润。


 
浸润性前列腺癌:仅有散在良性腺管的肌上皮细胞标记p63(棕色),肿瘤腺体肌上皮被破坏,基底膜不存在,p504S(红色)标记肿瘤细胞。



 E-cadherin &P120 Catenin:乳腺小叶癌        
       E-cadherin与p120 Catenin双染可用于区别乳腺导管癌与乳腺小叶癌。乳腺导管和导管癌表达E-cadherin,反之在乳腺小叶癌不表达。而p120 Catenin在乳腺小叶癌出现阳性表达。

 
 乳腺小叶癌:E-cadherin在良性的乳腺导管中表达(棕色),p120 Catenin在肿瘤细胞中表达 (红色)。


Ki-67& Mammaglobin Cocktail:乳腺癌
       Ki-67与Mammaglobin Cocktail双染可反应乳腺肿瘤细胞的增生活跃情况。

 
 乳腺癌:Mammaglobin Cocktail标记肿瘤细胞 (红色),Ki-67标记增殖期细胞(棕色)。


Kappa & Lambda:扁桃体
        Kappa和Lambda与人体免疫球蛋白的轻链发生免疫反应,标记相应的B细胞,浆细胞和免疫母细胞。正常淋巴组织和淋巴组织反应性增生时其Kappa和Lambda标记的淋巴细胞比例相似。如果Kappa/Lambda比例超过3或Lambda/Kappa比例大于2,或单一的任何一个标记的细胞数大于75%则意味着淋巴增生性失调,如B淋巴瘤,骨髓瘤等。

   
                                               扁桃体:Kappa (棕色),Lambda(红色)。


Ki-67&PHH3:扁桃体
       Ki-67标记增生期的细胞,PHH3标记细胞增殖周期中的有丝分裂期。

 
扁桃体:Ki-67(红色)标记所有增殖期细胞,PHH3(棕色)标记处于增殖期中的有丝分裂阶段的细胞。


参考文献:
1. Chris M, et al. J. Histochemistry & Cytochemistry 2008; 56(4):313-328.
2. Jules M. Immunohistopathology.1990;32-35.
3. Daniel Pirici, et al., J. Histochemistry & Cytochemistry 2009; (57(6):567-575

 

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