联系我们

电话: 020-32299997

传真: 020-32290284

邮箱: gzlbp@126.com

首页 > 技术研究 > 荧光原位杂交(FISH)专区
非小细胞肺癌EML4/ALK的检测方法
  肺癌是常见恶性肿瘤之一。基于生物学特性、治疗和预后,肺癌可分为NSCLC 和小细胞肺癌,其中NSCLC 约占80%~85%。分子靶向治疗是目前NSCLC 治疗中最热门也是最具前景的领域之一。研究发现EML4/ALK融合基因中所有ALK 基因融合都发生在20 号外显子编码的一段序列,而EML4 断裂点则表现出多变性,已经检测到的断裂点有2、6、13、14、15、17、18、20 号外显子,形成了多种EML4-ALK 融合基因型[1-2]。它们中的大部分被证实有促进肿瘤生成的活性[3]。在非小细胞肺癌中,EML4/ALK 融合基因因其对ALK抑制剂Crizotinib 应答良好[4],已成为当前研究的热点。晚期NSCLC患者使用ALK—TKI治疗前必须检测是否存在EML4/ALK基因融合。对于潜在怀疑存在EML4/ALK基因融合的患者均可进行EML4/ALK融合基因检测。
ALK融合基因的检测方法
  目前研究报道的肺癌组织中EML4/ALK融合基因检测的阳性率有很大差别,除了病例选择上的偏倚外,检测方法的不统一、无标准也是主要相关原因。用于检测ALK融合基因方法有很多种,常用检测的方法主要有3种:免疫组织化学方法(IHC)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交技术(FISH),但目前仍无敏感特异稳定的方法用于EML4/ALK分子检测[5]。
IHC
  IHC法是实验室最常用的蛋白筛查与诊断方法,操作简便、方法成熟等特点,且已有研究表明IHC检测EML4-ALK融合基因的结果和RT-PCR、FISH法的检测结果具有一致性,建议使用IHC法作为筛查EML4-ALK融合基因的方法。但ALK重排的变异种类多,在部分重排样本中ALK蛋白可能不表达,或表达水平相对较低,加上IHC法的敏感性不如RT-PCR和FISH法,因此ALK染色较弱或较集中的活检标本仍需要用FISH进行确认[6-7]。
RT-PCR
  RT-PCR法是一种敏感性高的基因检测方法,RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种RNA的含量。通过对EML4-ALK融合基因各种不同亚型进行专门引物的设计,可以分辨出各种不同亚型的EML4-ALK融合基因。RT-PCR法检测ALK融合基因的特点在于快速、简便易行、能同时明确ALK基因已知的融合变体的类型。由于此技术对RNA提取的质量要求较高,石蜡切片中的DNA及RNA在检测过程中会逐渐降解,影响检测结果的准确性[8]。此外,在NSCLC中已陆续发现了20多种不同的ALK基因融合变体,不能排除仍有未知融合变体的存在,因而RT-PCR检测有假阳性结果倾向[9]。所以,无法检测未知的融合型是其最大的不足之处。这些因素限制了RT-PCR在ALK融合基因诊断中的应用。
FISH
  目前大部分ALK阳性NSCLC的临床试验均是基于FISH的诊断。美国食品药品监督管理局(FDA)已批准的FISH分离探针试剂盒(Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit;Abbott Molecular,Inc.)可用于检测ALK融合基因的表达。FISH法采用探针特异性标记细胞核中ALK断裂点来检测ALK重排,分离的荧光信号提示存在ALK重排[10-11]。当IHC结果为弱阳性或阳性部位十分有限的时候,可用FISH法进行确认。
  虽然FISH检测目前仍是确定ALK融合基因的参照标准方法,但ALK分离探针有也存在不足之处,不能明确ALK融合基因的具体融合变体。研究发现在肺癌中ALK除了与EML4发生融合还与其他基因发生融合,例如前人研究中就有提到在肺癌中ALK还与TFG、KIF5B等发生融合。
  依据ALK和EML4断裂重排方式,基于FISH 法研制开发EML4/ALK融合基因荧光探针用于该融合基因检测。是针对FISH技术ALK分离探针不能明确ALK融合基因的具体融合变体的不足的一项有益补充。本探针以确诊为非小细胞型肺癌患者的石蜡包埋肺癌组织切片为检测对象,用荧光原位杂交的方法检测非小细胞型肺癌细胞中是否存在EML4/ALK融合基因,作为判断预后、肿瘤分型以及指导靶向药物治疗的一项辅助检测手段。
  ALK融合基因检测方法各有优缺点,存在一定的互补性。应根据需求结合临床上述多种技术都可以选择,有效利用各种检测分析技术,以获得最佳检测效果。

参考文献

[1] Soda M, Choi Y L, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK  fusion  gene in non–small-cell lung cancer[J]. Nature, 2007, 448(7153): 561-566.
[2] Takahashi T, Sonobe M, Kobayashi M, et al. Clinicopathologic features of non-small-cell lung  cancer with  EML4-ALK fusion gene[J]. Ann Surg Oncol, 2010, 17(3): 889-897.
[3] Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature, 2007, 488(7153): 561-566.
[4] Camidge D R, Bang Y, Kwak E L, et al. Progression-free survival(PFS) from a phase I study of crizotinib  (PF-02341066) in patients with ALK-positive non-small cell lung cancer(NSCLC)[J]. J Clin Oncol, 2011, (suppl): abstr 2501.
[5] Sasaki T, Rodig SJ, Chirieac LR, et al. The biology and treatment of EML4-ALK non-small cell lung cancer. Eur J Cancer,2010,46(10):1773-1780.
[6] Rodig SJ, Mino-Kenudson M, Dacic S, et al.Unique clinicopathologic features characterize ALK-rearranged lung adenocarcinoma in the western population. Clin Cancer Res, 2009, 15(16): 5216-5223.
[7] Mino-Kenudson M, Chirieac LR, Law K, et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clin Cancer Res, 2010, 16(5): 1561-1571.
[8]  Martelli MP, Sozzi G, Hernandez L, et al. EML4-ALK rearrangement in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues. Am J Pathol 2009;174(2):661–670.
[9] Takeuchi K, Choi YL, Soda M, et al. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK
fusion transcripts. Clin Cancer Res 2008;14(20):6618–6624.
[10] Perner S, Wagner PL, Demichelis F, et al. EML4-ALK fusion lung cancer: a rare acquired event. Neoplasia, 2008, 10(3): 298-302.
[11] Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with nonsmall-
cell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol 2009;27(26):4247–4253.

友情链接