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标记细胞增殖的免疫组织化学新抗体PHH3
 
磷酸化组蛋白H3 (Phosphohistone H3,PHH3)
 
         
         显微镜下检测细胞有丝分裂活动是判别恶性肿瘤如肉瘤、脑膜瘤、乳腺癌等肿瘤分级的常规程序。对于肿瘤的病理分级,一个有重要价值的指标是细胞的增生活性,通过计数高倍镜下每10个细胞中的有丝分裂细胞数(MF/10HPF)来判断。但是,这种方法通常受到阅片者的主观影响,加上有时难以与凋亡细胞、坏死细胞及核碎片相区别,其计数结果的准确性和重复性较差,在这种情况下对病理医生的经验有较高要求。由于有丝分裂细胞计数是基于高倍视野下计数肿瘤细胞的有丝分裂数而不是计数具体多少肿瘤细胞中的有丝分裂数。所以,MF/10HPF不是一个真正的细胞增生指数而仅仅是一个估值。更有甚者,在组织缺氧,固定延迟,或固定不当的情况下,有丝分裂体可浓缩导致分辨困难。因此,一种可用于准确判断细胞增生指数的免疫组织化学标记抗体是非常有临床价值的。不幸的是,现在多数商业用的免疫组织化学标记有丝分裂指数的抗体预测的有丝分裂指数比实际的有丝分裂活性要高。这可能是因为细胞的有丝分裂体仅仅短时间地出现在细胞周期的M期。而一种标记细胞增殖的抗体MIB1/Ki-67标记了几乎细胞增生周期的各个时期,它与免疫组织化学染色增生细胞胞核的抗体如PCNA被建议为评价增生活性的一种替代方法。与MF/10HPF相比,MIB1/Ki-67标记指数被认为可以反应细胞增生指数。但是,Ki-67标记除G0期外的整个细胞周期。很多的Ki-67核表达阳性的细胞可能在细胞周期中凋亡而不能存活。因此,有可能使其判断预后的价值大打折扣。虽然理论上用MIB1/Ki-67指数与有丝分裂指数比较对决定细胞增生没有明确的缺点,但实际过程中由于免疫组织化学操作的程序及计数方法等的不同,导致实验室之间差异性大,使其对标准化的肿瘤分级很困难。而有丝分裂体发生在细胞周期的后阶段,一旦形成能很可靠地代表细胞增生,因此,任何理想的标记细胞增生的免疫组织化学抗体应该仅仅表达在细胞周期的G2期和M期。

        最近的研究发现组蛋白H3是一个核心组蛋白,在真核细胞中与其他的组蛋白共同构成染色质中主要的蛋白组分。在哺乳动物的细胞中组蛋白H3的10位丝氨酸磷酸化在细胞间期几乎可以忽略,但在细胞的有丝分裂期其磷酸化在染色质浓缩体中达到峰值。如果一个抗体可以直接与磷酸化的组蛋白H3结合,就可以成为一个可靠的,有力度的判断细胞有丝分裂活性的标记物9。

        研究发现磷酸化组蛋白H3 (PHH3)抗体,能够特异地检测到10位或28位的丝氨酸被磷酸化的组蛋白。这个磷酸化过程在细胞间期几乎不发生,而仅发生在有丝分裂期,而且细胞凋亡时组蛋白不发生磷酸化。因此,PHH3可作为一个有效的在免疫组织化学中应用的细胞有丝分裂标记抗体。

        Kim等人研究发现用PHH3计数确定有丝分裂指数比传统的H&E染色有丝分裂计数更敏感。如果用WHO建议的有丝分裂指数阈值判断脑膜瘤的分级,有28例需要改变其病理分级,其中,27例从WHO分类的I级变为II级,1例从II级改变为III级,这些病例中有3例复发。Kim在研究中发现如果在高倍镜下PHH3染色的有丝分裂体大于或等于6个,提示脑膜瘤有复发的高危险系数。如果用传统的H&E染色方法计数有丝分裂指数,36%的脑膜瘤有复发的风险,但用PHH3计数有丝分裂指数,56%脑膜瘤有复发的风险。因此,用PHH3有丝分裂计数判定脑膜瘤复发风险比H&E方法更为敏感。

      
                  (图1a)                                                                    (图1b)
图1a和1b:PHH3(棕色)和Ki-67(红色)双染,神经胶质瘤,Ki-67标记细胞整个增生期,PHH3只标记细胞有丝分裂期。
图1b的有丝分裂体多过图1a,表明图1b的肿瘤分级可能更高。
 
         根据现有的WHO分级系统,区分浸润性恶性星型细胞瘤II级与III级主要是根据恶性肿瘤细胞的增殖活性,当然它也是判断预后和决定治疗的重要指标。Colman研究表明,免疫组织化学检测PHH3判断有丝分裂增生指数与MIB1/Ki-67有相比性,但明显地比H&E计数方法更为敏感。
 
        PHH3在恶性黑色素瘤中的表达明显高于Spitz色素痣。前者平均25/HPF,后者0.5/HPF。因此,PHH3可辅助病理医生区分恶性黑色素瘤与Spitz色素痣。70岁以下的乳腺癌患者,细胞有丝分裂指数对预后的判断其价值比传统的预测指标要高。一组研究表明,PHH3的表达与肿瘤大小、雌激素受体、肿瘤的分级和有丝分裂的指数有密切相关性。研究同时发现,在年龄55岁以下的淋巴结无转移乳腺癌患者中,PHH3胞核染色是目前最有效的判断化疗的预后指标。
 
        综上所述,磷酸化组蛋白H3是一个非常有潜力的、高效的标记细胞有丝分裂的免疫组织化学抗体,同时可用于鉴别细胞凋亡体、核碎片。为中枢神经系统肿瘤、黑色素瘤、软组织肿瘤、乳腺癌等提供细胞有丝分裂信息,对于指导肿瘤病理分级,预后的判断甚至治疗起到非常重要的作用。
 
技术小贴士:
1. PHH3可与Ki-67双染,能提供更多及更精确的信息。
 
                          (图2a)                                                                     (图2b)
图2a:扁桃体,PHH3(红色)和Ki-67(棕色)双染,Ki-67标记细胞整个增生期,PHH3只标记细胞有丝分裂期。
图2b:Ki-67标记扁桃体的生发中心。
2. 细胞定位:胞核(有丝分裂体)。见图3
3. 阳性质控:扁桃体生发中心。见图3
4. 阴性质控:扁桃体的T细胞区和滤泡间区。见图3

                           (图3)
图3:扁桃体,PHH3染色生发中心淋巴细胞的有丝分裂体,T细胞和滤泡间区细胞无染色。


参考文献
1. Rosai, J. Int J Surg Pathol 2005;12:155
2. Van Diest PJ, et al. Hum Pathol 1992;23:603-7.
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